抗體為基礎的免疫療法在各種類型的癌癥中顯示出臨床有效性。然而，其靶標范圍僅限于表面或可溶性抗原，而這些抗原在癌癥蛋白質(zhì)組中只占相對較小的比例。人類蛋白質(zhì)組中的大多數(shù)蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)的。而來自細胞內(nèi)的短肽可以被細胞表面的MHC I類（MHC-I）分子所呈現(xiàn)，使其成為使其成為癌癥免疫治療的潛在目標?？梢蚤_發(fā)出針對這些肽/MHC復合物的抗體，以發(fā)揮類似TCR識別MHC-I/肽復合物的功能。這些抗體被稱為T細胞受體模擬（TCRm）或TCR樣抗體。

一項癌癥蛋白質(zhì)組研究分析了17種主要癌癥類型的轉(zhuǎn)錄組。發(fā)現(xiàn)有500多個基因與正常細胞向癌細胞的轉(zhuǎn)化有關，其中近一半的基因編碼的是細胞內(nèi)蛋白。而另外一些蛋白質(zhì)表達在細胞表面，它們可以成為癌癥免疫療法的目標如mAb和CAR-T。這些細胞外蛋白包括CD19, CD20, CD22, CD47, CD52,CD80, CD123,HER2, EGFR, mesothelin, GPC3, GPC2, GD2, B7-H3和PD1/PDL1。然而，細胞內(nèi)的癌癥靶點并不能很好地被這些免疫療法所利用。因此，有必要開發(fā)出能夠在細胞內(nèi)進行免疫治療的藥物。

細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)可以被蛋白酶體降解8到10個氨基酸長的短肽。這些短肽被MHC I類（MHC）呈現(xiàn)在細胞表面。一些肽/MHC復合物(pMHC)已被證明與各種癌癥有關，因此其可以成為TCR治療的潛在靶標。這些復合體可以被用于開發(fā)抗體。靶向pMHC的抗體通常被稱為TCR模擬（TCRm）或TCR-like抗體，因為它們能夠像T細胞上的TCR一樣識別復合物。肽來自于各種細胞內(nèi)的腫瘤抗原如病毒性腫瘤基因產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄因子、胎盤蛋白、癌睪丸抗原等或來自突變的癌基因的新抗原。TCRm抗體擴大了治療目標的范圍，具有廣泛的臨床潛力。

腫瘤中pMHC靶標的選擇

開發(fā)TCRm抗體時，pMHC的選擇主要考慮以下因素：表位的豐富程度，癌細胞與正常細胞的特異性，MHC分子的表達，以及在腫瘤細胞上表達的異質(zhì)性。TCRm抗體的理想目標是一個癌癥特異性pMHC復合物，該復合物在目標細胞表面有很高的密度，而在正常細胞上不存在?；蛘呤悄繕丝乖谀[瘤生長中具有功能性甚至是關鍵性作用，從而避免在隨后的治療中，該抗原因治療壓力而丟失。該多肽還應該對病人的MHC有很高的親和力，并形成一個穩(wěn)定的復合物，且在腫瘤細胞表面持續(xù)表達，從而允許TCRm抗體的識別。TCRm抗體開發(fā)的一個主要挑戰(zhàn)是腫瘤細胞往往下調(diào)MHC-I的表達。

HLA是pMHC復合物的一個主要部分，因此選擇HLA進行癌癥治療非常重要。HLA I在不同的人類群體中有超過20000個等位基因。同一個癌原性的肽可能在不同的人群中中呈現(xiàn)有不同的HLA等位基因。因此，開發(fā)TCRm抗體時，為了能以擴大其臨床應用，HLA亞型的選擇應需要重點考慮。有研究表明，在白種人中最常見的HLA I類等位基因是HLA-A02, 24,01和HLA-B_35, 44, 51;而亞洲人種中為HLA-A_24, 02, 26和HLA-B_40, 51, 52; 非裔巴西人中主要為HLA-A_02, 03, 30 和HLA-B_35, 15, 44。因此，HLA-A_02是TCRm抗體開發(fā)比較理想的候選者。

根據(jù)其短肽成分的來源，pMHC復合物可大致分為以下兩大類腫瘤相關抗原（TAA），包括過度表達的蛋白質(zhì)，和腫瘤特異性抗原（TSA）。TSA包括腫瘤特別的融合蛋白、致癌病毒抗原和變異的自身抗原。表1中所列的抗原已被研究證明的細胞表面表達的pMHC復合物，使其成為TCR細胞治療或CRm抗體開發(fā)的目標。目前，細胞表面的pMHC復合物的發(fā)現(xiàn)和驗證主要是通過復雜的蛋白質(zhì)組學方法，包括質(zhì)譜分析等，因此目前可以靶向的pMHC復合物相當有限，這也在一定程度上限制了TCRm抗體的開發(fā)。

TAA

TAAs主要由腫瘤細胞表達，并與惡性腫瘤細胞表型相關，這是靶向癌癥免疫療法的基礎。在TAAs中，異常過度表達的抗原是最大的一類，研究表明，針對部分TAAs抗原（如，癌胚胎抗原WT1，α-甲胎蛋白和在黑色瘤中表達的PRAME和NY-ESO-1等腫瘤-睪丸抗原）的一些療法已經(jīng)取得初步成功，如疫苗、過繼性細胞療法和抗體等。癌胚胎抗原WT1和AFP在胚胎發(fā)育過程中表達，并且在一些特定的腫瘤中也表達，但在健康的成人組織中的表達非常有限。癌睪丸抗原包括MAGE基因家族和NY-ESO1在幾種腫瘤類型中高度表達，但在健康的成人組織中的表達幾乎檢測不到。這些TAAs已被充分證明，可以作為CTL，TCR-T或者TCRm抗體的有效靶標，用于腫瘤的治療。

TSA

TSA是癌癥免疫治療比較有吸引力的靶標，因為TSA是由腫瘤細胞特異性表達的，因此免疫治療效果僅限于腫瘤，并且能最小化脫靶導致的副反應。目前研究表明，某些融合蛋白僅在腫瘤細胞中表達，如BCR-ABL和PMMA。BCR-ABL融合（費城染色體）是由9號染色體和22號染色體之間的易位導致的。這種易位對CML的發(fā)病機制至關重要，在95%的CML患者中可以檢測到，而在正常細胞中則沒有。PML-RARa融合引起的易位，是急性早幼粒細胞白血病（APL）的一個標志性特征。這種易位產(chǎn)生的融合蛋白作為一種異常的視黃醇受體，具有異常的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特性。有研究使用BCR-ABL肽作為疫苗，但是在臨床中療效有限。

另外一種TSA是致癌病毒的抗原。據(jù)統(tǒng)計，人類癌癥中約有12%是由病毒引起的。目前已知有七種病毒可以導致癌癥的發(fā)生，包括EB病毒（EBV）、人乳頭瘤病毒（HPV），乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV），人類T淋巴細胞病毒1（HTLV-1）、卡波西肉瘤相關的皰疹病毒（KSHV）和梅克爾多元癌細胞病毒（MCPyV）。致癌病毒的致癌作用是復雜的，只有一小部分受感染的人會發(fā)展成癌癥，而且往往是在最初感染后的許多年或幾十年才發(fā)生。這些病毒的致癌基因在癌細胞中為構成性表達，因此它們成為癌癥治療較好的靶標。開發(fā)TCRm抗體治療EB病毒相關的癌癥已被證明是可行的。EB病毒與一些癌癥有關，如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌。來自EBV的多肽，包括EBNA1562-570、LMP1125-133和LMP2A426-424由HLA-A0201呈現(xiàn)在腫瘤細胞表面，因此這些多肽成為TCR抗體的潛在目標。研究結果表明，用TCRm抗體治療EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞的異種移植小鼠時，這些轉(zhuǎn)化細胞的生長被抑制，而且小鼠的存活率顯著提高。另外，TCR細胞療法靶向HPV E6或E7多肽復合物也取得了一定的效果。

變異的自身抗原或新生抗原是癌癥免疫療法的最佳目標，因為它們僅在惡性腫瘤細胞中表達細。然而，腫瘤突變的在腫瘤患者之間并不完全相同，只有少數(shù)患者有相同的新生抗原。在大多數(shù)情況下，針對這些不同的新生抗原開發(fā)TCRm抗體是非常困難并具有一定的挑戰(zhàn)，因為其臨床應用比較有限。幸運的是，研究發(fā)現(xiàn)了頻發(fā)突變（recurrent mutations）（>1%的的患者），這些可能是頻發(fā)性的新抗原，如P53，KRAS和 Myc。腫瘤抑制因子p53在各種癌癥中失調(diào)，因此是免疫治療的重要目標。p53在結直腸癌中有兩個常見的突變R175H和R282W，突變的頻率為9.5%。最近的一項研究開發(fā)了一種針對p53 R175H突變的TCRm雙特異抗體。該雙特異性抗體能有效地激活T細胞，并特異性的殺傷具有這種突變的癌細胞。KRAS突變在多種癌癥中都比較常見，如胰腺癌(70%-90%），結腸癌（35%-50%），小腸癌（35%），膽道癌（35%），(35%），膽道癌（20%-30%）和肺癌（20%-35%）。在胰腺癌患者中，KRAS G12D是最常見的突變（32.4%），其次為G12D突變（22%）。有研究證明，靶向KRAS G12V突變肽與HLA-A3復合物的雙特異抗體能對腫瘤進行了特性殺傷。

pMHC復合物的表達
 

pMHC是由HLA I類重鏈、b2-微球蛋白(b2M)，以及來自腫瘤抗原的肽組成的復合物。肽位于HLA分子的結合槽中，MHC分子的側鏈和肽的骨架之間通過比較保守氫鍵相互結合。一個pMHC復合物的原生構象對于分離出一個成功的TCRm抗體至關重要。使用目前的技術，如雜交技術和噬菌體展示技術，生產(chǎn)pMHC復合物的抗體具有一定的挑戰(zhàn)性，因此TCRm抗體并不像傳統(tǒng)的抗體容易獲得。

重組pMHC復合物的出現(xiàn)，推動了TCR抗體的發(fā)展。使用不同的策略來分離TCR抗體，首先需要相對大量的純化的MHC-肽復合物。起初，有研究者將MHC分子的重鏈和b2M利用細菌單獨表達并且通過包涵體純化獲得，然后，它們將MHC與肽重新折疊，產(chǎn)生正確的重新折疊的pMHC復合物（圖2B），這些獲得的復合物需要通過功能實驗和其它一些實驗驗證復合物結構的正確性。總的來說，與其他細菌或哺乳動物表達的抗原制備相比，該方式產(chǎn)量很低，而且生產(chǎn)過程很繁瑣。為了提高生產(chǎn)效率，有研究者將MHC重鏈和B2M和肽通過linker連接，并且以融合蛋白的形式表達（圖3）這些重組的pMHC復合物可以被不同的TCR識別，與原生的pMHC復合物相似。結構研究顯示，其與天然的pMHC復合物在結構上有一些差別，特別是在a1a2結構域。然而，在抗原結合活性上，兩者的差異可能比小。最初，這些融合蛋白的主要是用于產(chǎn)生四聚體或其他多價染色試劑用于觀察T細胞。pMHC單體的構象在四聚體的應用中可能并不重要。然而，一個原生的pMHC單體可能是TCRm抗體篩選比較理想的抗原。pMHC抗原生產(chǎn)的開發(fā)和優(yōu)化將是TCRm抗體發(fā)現(xiàn)的重要研究領域。

TCRm抗體的篩選和表達

在過去，TCRm抗體的篩選比較困難。但是隨著技術的進步，包括上述的pMHC復合物的表達，TCRm抗體的開發(fā)已經(jīng)有了很大的進展。越來越多的針對腫瘤和病毒抗原的TCRm抗體已經(jīng)被開發(fā)，包括WT1, AFP, PRAME, NY-ESO-1, MAGEA1,hTERT、TARP、Tyrosinase、hCGbeta、p53、p68 MIF、蛋白酶3，MAGE3和EB病毒蛋白。雜交瘤以及噬菌體展示進行體外篩選是目前兩種主要方法（圖2A）。另外，單個B細胞分選和克隆也逐漸成為TCRm抗體篩選的一種選擇。雜交瘤技術的主要優(yōu)點是，其分選到的TCRm抗體可能對pMHC復合物有較高的高親和力，這是因為這些抗體在免疫過程可能經(jīng)歷過親合力成熟的過程。然而，該方法需要穩(wěn)定的MHC復合物與肽有較高的親和力，因為這是免疫有效的前提，而且是抗體成熟中所必須的。另外，通過這種方法篩選的抗體進入臨床實驗，也必須進行人源化，以消除抗體的免疫原性。

噬菌體展示技術很大程度的促進了TCRm抗體篩選的成功。在分離TCRm抗體方面取得了成功。特異性對于TCRm抗體的成功很重要，噬菌體展示可以結合陰性和陽性篩選來分離出高度特異性的TCRm抗體，而雜交瘤通常不能做到這一點。噬菌體展示的另一個重要特點是抗體庫通常具有很大的多樣性?？贵w可以Fab或者scFv的形式展示在噬菌體顆粒上。該方法的主要優(yōu)點是可以對目標進行廣泛的選擇并且在短時間內(nèi)獲得目的抗體。另一個優(yōu)點是，其可以產(chǎn)生完全人源化的抗體，因此無需進行人源化。然而，來自噬菌體庫的TCRm抗體的親和力通常具有較低，因此可能需要親和力的成熟。

TCRm抗體與pMHC復合物結合的方式?jīng)Q定了其性質(zhì)

TCRm抗體與pMHC復合物結合的結構信息對開發(fā)針對不同患者群體的治療方法很有價值。TCRs與pMHC復合物的親和力在1到100mmol/L之間，而TCRm抗體可以有更高的親和力。例如，ESK1，一種針對WT-1的TCRm抗體，其對WT-1具有亞納摩爾的親和力，比天然TCR的親和力高1000倍。與TCRs和其他TCRm 抗體對pMHC復合物的結合方式相比，ESK1具有不同的模式（圖4）。ESK1的可變區(qū)結構域結合在HLA區(qū)域是TCRs無法觸及的區(qū)域。此外，ESK1結合部分多肽，而這些多肽只占總的pMHC接觸面的15%。肽上的結合比例在各種TCRm抗體中是不同的。最近發(fā)表在Science上的一項研究表明，H2-scDb抗體與肽和HLA-A02都有結合，并且與兩者的接觸面分別占50%左右（圖5）。此外，晶體結構研究顯示，ESK1與HLA受體和多肽的結合率高達85%。有趣的是，這個區(qū)域在HLA-A02亞型之間是比較保守的。因此可以推測，ESK1可以與HLA-A02家族的其他亞型結合，并且這種推測已經(jīng)通過親和力實驗得到驗證。這潛在地擴大了具有不同HLA-A02亞型的目標病人群。除了基于可溶性TCR的構建體和TCR工程細胞外，基于TCR的藥物的一個主要限制是，它們對特定HLA亞型的限制。結構上的發(fā)現(xiàn)表明ESK1可能可以克服HLA亞型限制的限制。因此，TCRm療法可能有比基于TCR的藥物有更廣泛的治療應用。

TCRm抗體在治療中的應用

TCRm抗體為癌癥治療提供了新的基于抗體的免疫治療的方法。表2列出了已經(jīng)被報道的用于腫瘤治療的TCRm抗體。從篩選方式上來看，基本上所有TCRm抗體都是通過噬菌體展示和雜交瘤篩選。

與傳統(tǒng)的抗體藥類似，TCRm抗體通過抗體依賴性細胞細胞毒作用（ADCC），細胞毒性（ADCC）、抗體依賴性細胞吞噬（ADCP）或補體依賴性細胞毒性（CDC）等發(fā)揮作用。在研究中，可以使用不同的方法，包括增強ADCC、ADCP、工程雙特異性mAbs、免疫毒素、抗體藥物結合物（ADC），以及與其他治療方式相結合等，提高TCRm的藥效。例如，經(jīng)過改造的ESK1抗體ESKM，增強了對FcgR的結合和減弱了對FcgRIIb的結合能力，從而抗體的ADCC效應。此外，ESKM可以和各種酪氨酸激酶抑制劑的聯(lián)合使用提高治療效果。

TCRm抗體同樣也可以被開發(fā)用于CAR T細胞治療。CAR主要由特異性的細胞外抗體部分、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細胞質(zhì)區(qū)（包括CD3 zeta鏈和一些共刺激結構域）組成。一些基于TCRm抗體構建的CAR-T已經(jīng)被報道，如利用WT1 抗體構建的CAR-T已經(jīng)在體外和體內(nèi)實驗中取得療效；同時也有研究者構建靶向gp100 pMHC復合物的CAR-T療法，用于治療黑色素瘤。. 由這種TCRm衍生的CAR T細胞顯示了對腫瘤的特異性細胞毒性，并在異種移植模型中抑制了黑色素瘤的生長。目前，AFP CAR-T細胞療法是進展最快的基于TCRm抗體構建的CAR-T療法，正在進行臨床試驗（NCT03998033）。該療法由Eureka開發(fā)，在臨床前研究中，該療法在多種肝癌模型中取得了較理想的結果。

TCR融合蛋白

當然，除了利用抗體結合pMHC復合物外，immunocore公司開發(fā)了TCR融合蛋白+抗體的ImmTAC平臺，該平臺中，改造后的融合蛋白以更高的親和力與pMHC（HLA）復合物結合，而其抗體部分通過與T細胞表面的CD3結合，從而激活T細胞對腫瘤細胞進行殺傷。目前基于該平臺構建的Tebentafusp（靶向HLA-A*02:01和gp100復合物）已經(jīng)位于臨床Ⅲ期，并且預計今年第三季度申請BLA。

總結
 

TCRm抗體目前大多數(shù)都處于臨床前。而且TCRm抗體的開發(fā)仍然面臨著幾個重要的挑戰(zhàn)。首先是pMHC復合物表達，生產(chǎn)足夠多的高質(zhì)量pMHC復合物既費時又費力。其次，脫靶效應可能阻礙了TCRm抗體治療的應用，因為多數(shù)pMHC復合物可能不只在腫瘤細胞中表達，而且可能在正常組織中表達量很低。此外，因為pMHC中的肽都比較短，TCRm抗體可能與其pMHC復合物存在交叉反應性。而單域抗體也許可以解決以上問題，與其它抗體相比，單域抗體較小，而且僅有重鏈，因此可以深入到pMHC結合肽的“溝”中，從而特異性結合肽與pMHC的構象型表位，另外，單域抗體可以很容易的構建雙表位的抗體甚至三表位的多特異性抗體。最后一個挑戰(zhàn)是，細胞表面的MHC-I復合物的表位密度低，以及抗原表達的下調(diào)并造成耐藥性?，F(xiàn)在有一些可能的方法可以用來解決這一挑戰(zhàn)，如增加腫瘤中pMHC-I的表達，或者使TCRm抗體對低密度表位更加敏感，或者與其他藥物聯(lián)合治療，以及設計雙特異性的TCRm抗體等。

TCRm抗體可以將抗原范圍擴大到細胞內(nèi)的蛋白，并有可能使許多 "不可成藥 "的靶標可用于免疫治療。盡管還需很多努力來分離出特異性好的的TCRm抗體，但它們在靶向細胞內(nèi)蛋白方面具有很好的治療潛力。分離出更多針對現(xiàn)有的抗原或者新的抗原的TCRm抗體，改進pMHC復合物的生產(chǎn)，TCRm抗體的研究，包括單域抗體的使用，抗體傳遞，結構研究，以及TCRm的親和力成熟和減少TCRm抗體的免疫原性將推動針對細胞內(nèi)靶標的治療并有可能在未來將有效的抗體推進到臨床應用。

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